毕赤酵母GS115基因组研究进展
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毕赤酵母GS115基因组研究进展
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摘要：巴斯德毕赤酵母的生物表达系统成功表达了多种重组外源活性蛋白，广泛应用于能源、医疗和科学研究。本文综述了'以来毕赤酵母的基因组研究，从分子水平上解释了其转录调控、表达调控和翻译后修饰的机理，目的是解决毕赤酵母发酵过程中产量下降、糖基化过剩等瓶颈问题。关键字：毕赤酵母()(*$，Genome，Progress0/)，1234/)5/)，32，6/)，*'7/)，8(1234/)43/54/3@A-1B/4；0a，2653360----！'$，356(()4%':(.()，$%)但)。-；*2中文图分类号：b(*c'%接受日期：F*%！通讯员作者：王永刚(*F)》，男，硕士，研究方向：生物化学和分子生物学。项目：兰州理工大学学生科技创新基金项目兰州市科技局项目(！GG).随着人类生产生活的进步，能源危机、环境污染、人类健康等问题也在持续。需要制定快速、准确、有效的方法来为解决这些问题提供新的方法。随着基因操纵技术的成熟，生物表达系统的出现迅速满足了世界各国科学家的需要，成为解决工业、农业、医疗等领域问题的主要手段之在生物表达系统中，毕赤酵母(！“$'%'()，HI)表达系统的研究最为广泛，是本世纪初发展起来的新的外源蛋白表达系统。与其他表达系统相比，弥补了大肠杆菌表达系统复杂蛋白质难表达的局限性，以及植物和动物细胞表达系统周期长、操作繁琐、成本高等缺点，同时改善了酿酒酵母(%$*)、-)。分泌效率低，表达菌株不稳定，表达质粒容易丢失等。迅速成为各国科学家研究的宠儿。迄今为止，数百种外源蛋白质在该系统中正常表达，数量不断增加。本文旨在分析毕赤酵母($%)的全基因组序列及其表达系统的最新研究进展进行了综述。研究背景巴斯德毕赤酵母作为最简单的真核生物，一直被科学家视为模式生物。特别是*FFE月完成了酿酒酵母的DNA测序，是真核遗传学的一个里程碑。人类首次获得了操作简单、实验生物体系完整的真核生物基因组完整的核苷酸序列。人类基因组酿酒酵母的研究在低等真核生物的生活习惯、人类基因调控、遗传病和人类进化的发病机制的阐明、人类基因功能的解读等方面取得了巨大的成果。另外，大肠杆菌以来，酿酒酵母首次被用作外源基因表达的真核宿主菌。但是，重组蛋白在表达过程中存在分泌效率低、表达菌株不稳定、表达质粒容易丢失等缺点。因此，人们逐渐建立了一种能够高效稳定表达外源基因的新表达系统，即甲醇营养型毕赤酵母(J/@；a.-@9-I；34个A/6？@)表达系统。克服了酿酒酵母表达系统的诸多缺点，已成为国内外广泛应用于外源真核蛋白和其他复杂质子核蛋白大规模生产的理想表达系统。但是，毕赤酵母作为新型的外源蛋白表达宿主，已经商业化多年，但对其作用机制的研究相对较少，特别是对基因调控原理和诱导机制的研究很少。因此，为了明确外源蛋白在毕赤酵母中的表达机制，外源蛋白的K/？/694；-9I-96@3-5B/4；5-.-03/、lmn(o.657/9？M5？@3@研究方法9223中，通过甲醇与酵母984！属于$*，*，4993-$.4993全基因的完全测序主要依靠第二代测序技术
与放大胶乳类(GBD@%)相比。-@E@'G)和皮肤的焦磷酸盐(HE*)进行升级。@AB-%-C)适用于各种生物的全基因序列分析。通常在全DNA测序过程中，结合多种技术进一步证明基因组的完整性和准确性。4993全DNA测序中，KD'*。h(。*@%@((ijk)，@)-C*测序技术主要用于进一步补充和完善全基因组序列，具有重要作用。基本战略是，首先比较高质量的4993基因组文库和$-T-)两端含有4993的72个代码序列[97]，生成12个不同的序列。对此应用IQ；7进一步证实了4993个全基因组序列。4条染色体上的注释，其大小为全基因组序列。当4993年全基因组测序并得到全基因组序列图时，工作的重点是分析数百万条染色体的序列。由碱基对线形序列形成的长链中包含的遗传信息包括基因结构的预测和功能注释。事先测试生物基因组的代码序列。%-C@AB-@，Q$或者打开浏览框(。H-M*)克，普；j)的方法可以分为序列的两个可编码性，例如利用基于隐马尔可夫模型的K4993基因序列和已知基因序列建立毕赤酵母同源基因模型，并与隐马尔可夫模型算法结合。
乙酰丙酮%；在M4A蛋白数据库中进行TW=4XV；5$60，0$%/，()，)，)，基因组序列$QEH)lxtw=4XV决定了编码序列、保存序列和内含子序列。最后进一步验证预测的3，797基因编码序列，通过TW=4XI获得酵母蛋白质数据库，u-%I*.’；M4AMB-C%蛋白质数据
库中比对分析，有7，226个基因有较高的同源性（TW=4XI3，@&AB&-&D&-C’(01“3，占全基因组81的基因长度。此外通过对>4993全基因组序列中单拷贝或低拷贝保守序列与’($6“%$*&’+，9“&-$(，$6$，5“’(’%$6*，2“3’+’4，*，$’，23-，:“*$33-$+“L全基因组序列的比对分析，发现0?8个编码蛋白基因是真核生物核心基因（QK>@）。在JUH指出一方面利用混合发酵的方式，通过添加山梨醇，控制甲醇与山梨醇比例、间歇式发酵；另一方面避免甲醇的使用，即采用可替代性的启动子如.;启动子，从根本上解决上述问题。A+DGIJD+8GK+等分析了-C糖基化、?C糖基化位点密码子的分析：由于蛋白质的糖基化及结构的变化在人类疾病及衰老等复杂生物学现象过程中起到很重要的作用，利用毕赤酵母表达蛋白糖基化修饰的特点来生产与人类有关的活性蛋白、解析医学疑难杂症等方面有很广泛的应用前景。7HQRGHJK8K+HHFM2+H8KRGKS2+KMMRHGRG8QKTK8Q==7KVRKWM，“000，“/：/&C3〔“〕;D8+RP5:，NP-KRB，K8JK8K+HHFM2+H8KRG2+HLFP8RHGFMRG>8QKKS2+KMMRHGM=M8KTXKDM8，“00&，““：“/4C“*0)〔!〕周璐，李越中，李健)酿酒酵母基因组学研究进展〔E〕)生命科学，%444，%%（“）：6*C4%)〔/〕$PQF88K+，，XDH’QKG>:RG，(RKQQ8FGRZFK[KD8F+KM8QK2+H8KRG2+HLFP8RHGQHM8KGHTK’HT2D+RMHGRGXKDM8$=M8KTD8RPM：，KKGK+D8RHGMKZFKGPK+M〔E〕)G8’〔E〕)-D8F+KBRH8KPQGH=，“006，“3（%0）：%%!&C%%/&)〔4〕WWW)+HPQKMPRKGPK)PHT)KGHTK$KZFKGPK+$=M8KTNH+KD22>KGHTRPM8+FP8F+D毕赤酵母基因敲除（Pichiapastorisgeneknockout）
毕赤酵母基因敲入（Pichiapastorisgeneknockin）
定制服务：开发特殊物种的基因组编辑系统
毕赤酵母基因敲除的传统方法是利用自身的Red系统对外源进入的DNA进行同源重组，从而实现目标基因的等位替换。通过设计靶基因的同源融合片段，将其克隆至自杀载体中，自杀载体通过接合输入到靶细菌。通过抗生素筛选细菌基因组靶位点整合有自杀载体的插入突变株。在第二轮反向选择压力下，只有毕赤酵母基因组发生第二次同源重组并丢失自杀质粒才可以存活。
关键词：毕赤酵母拷贝数蛋白分泌表达化学品生产分泌工程合成生物学
Abstract:Withmorethan20yearsofdevelopment，Pichiapastorissystemhasbeenextensivelyusedbothonalabandindustrialscale.ThisreviewoutlinestheprogressmadeonP.pastorisfromaspectsofproteinexpression，molecularengineeringtoolsandmethods，andbiochemicalproduction.Thisreviewalsoprovidesperspectivesonthecurrentchallengesandfuturedirectionsofthisimportantsystem.
毕赤酵母Pichiapastoris目前已是仅次于大肠杆菌的最常用蛋白表达系统，广泛应用于实验室规模的蛋白质制备、表征以及结构解析等方面，已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中得到成功地表达。近些年，毕赤酵母被美国FDA认定为GRAS(Generallyrecognizedassafe)微生物，为其在食品和医药上的应用铺平了道路。在医药蛋白领域，已有胰岛素、乙肝表面抗原、人血清白蛋白、表皮生长因子等多种蛋白使用毕赤酵母表达实现商品化制备[1]。在工业酶制剂领域，也有许多酶制剂包括植酸酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等利用毕赤酵母实现了产业化规模的生产[2]。关于毕赤酵母表达系统的基本元素、优势特点以及生理特性等，之前已有很多综述进行过系统的阐述[3，4，5，6]，本文不再赘述。本文旨在从工业技术应用的角度综述毕赤酵母近些年取得的进展，同时就毕赤酵母系统存在的问题以及未来的研究方向进行分析和展望。
与大肠杆菌和酿酒酵母等宿主不同，毕赤酵母自身没有稳定存在的游离型载体，所有的表达载体都要整合到酵母的基因组上。虽然有PAOXPGAP等强启动子，但由于整体上拷贝数较低，外源表达量不足。因此，早期的研究为了提高蛋白表达水平，主要是通过构建和筛选载体发生多次整合的多拷贝菌株来提高外源蛋白的产量。为了得到多拷贝菌株，人们设计了体外法和体内法两种策略[7]。体外法是在体外构建多拷贝载体，再将其转化至酵母宿主中。该方法优点是多拷贝转化子筛选到的几率较高，但缺点是分子克隆工作量大，由于载体大小的限制，一般最多可获得6-8个拷贝的载体。体内法是通过在载体上加入抗生素标记，如Zeocin、G418抗性基因等，将载体转化入宿主之后，可以通过提高培养基中抗生素浓度筛选多次整合的多拷贝转化子。该方法的优点是构建较为简单，缺点是筛选工作量较大、假阳性比率较高、拷贝数鉴定较为麻烦。
